Popis
Aptima HPV 16 18/45 genotype assay
Určené použití
Test APTIMA HPV 16 18/45 Genotype je amplifikační test cílové sondy nukleové kyseliny pro in vitro kvalitativní detekci E6/E7 virové messengerové RNA (mRNA) vysoce rizikových typů 16, 18 a 45 lidských papillomavirů (HPV) ve vzorcích žen s pozitivními výsledky testu APTIMA HPV. HPV mRNA je detekována v cervikálních cytologických Pap vzorcích v tekutém médiu ve zkumavkách ThinPrep obsahujících roztok PreservCyt před zpracováním Pap i po něm nebo v odebraných vzorcích pomocí odběrové a transportní soupravy APTIMA. Tento test lze použít k testování vzorků systémem TIGRIS DTS nebo systémem PANTHER.
Principy metody
Test APTIMA HPV 16 18/45 Genotype zahrnuje tři hlavní kroky, které se provádí v jedné zkumavce: zachycení cíle; cílová amplifikace pomocí transkripčně zprostředkované amplifikace (Transcription- Mediated Amplification – TMA), a detekce produktů amplifikace (amplikonu) pomocí testu hybridizační ochrany (Hybridization Protection Assay – HPA). Test zahrnuje vnitřní kontrolu, která monitoruje zachycení nukleové kyseliny, amplifikaci a detekci, a rovněž chyby operátora nebo přístroje.
Vzorky se odebírají nebo jsou přeneseny do zkumavky obsahující transportní médium, které lyzuje buňky, uvolňuje mRNA a chrání ji před degradací v průběhu uchovávání. Když se provádí test APTIMA HPV 16 18/45 Genotype, cílová mRNA je z vzorku izolována pomocí záchytných oligomerů, které jsou vázány na magnetické mikročástice. Záchytné oligomery obsahují sekvence, které jsou komplementární ke specifickým oblastem HPV mRNA cílových molekul, stejně jako řetězec deoxyadenosinových zbytků. Během hybridizačního kroku se sekvenčně specifické oblasti záchytných oligomerů váží na specifické oblasti cílové molekuly HPV mRNA. Komplex záchytného oligomeru a cíle je poté vychytáván z roztoku snížením teploty reakce na pokojovou teplotu.
Toto snížení teploty umožňuje hybridizaci mezi deoxyadenosinovou oblastí na záchytném oligomeru a polydeoxythimidinovými molekulami, které jsou kovalentně navázány k magnetickým částicím. Mikročástice, včetně zachycených cílových molekul HPV mRNA, které jsou na ně navázány, jsou zataženy ke straně reakční zkumavky pomocí magnetů a supernatant se odsaje. Částice se promyjí, aby se odstranila reziduální matrice vzorku, která může obsahovat inhibitory amplifikace.
Po dokončení zachycení cíle je HPV mRNA amplifikována pomocí TMA, což je metoda amplifikace nukleové kyseliny založená na transkripci, která využívá dva enzymy, reverzní transkriptázu MMLV a polymerázu T7 RNA. Reverzní transkriptáza se používá k vytvoření kopie DNA sekvence cílové mRNA obsahující sekvenci promotéru pro polymerázu T7 RNA. Polymeráza T7 RNA produkuje více kopií RNA amplikonu z kopie DNA templátu.
Detekce amplikonu je dosaženo metodou HPA využívající jednořetězcové sondy nukleové kyseliny s chemiluminiscenčními značkami, které jsou komplementární k amplikonu. Značené sondy nukleové kyseliny hybridizují specificky s amplikonem. Selekční reagencie rozlišuje hybridizovanou od nehybridizované sondy deaktivací značení nehybridizované sondy. Během detekčního kroku je světlo vyzařované z označených hybridů RNA:DNA měřeno jako fotonové signály v luminometru a intenzita je hlášena jako relativní světelné jednotky (RLU). Konečné výsledky testu jsou interpretovány na základě poměru signálu analytu k hodnotě cut-off (S/CO).
Vnitřní kontrola se přidává do každé reakce prostřednictvím činidla zachycení cíle (TCR – Target Capture Reagent). Vnitřní kontrola monitoruje zachycení cíle, amplifikaci a detekční kroky testu. Dvojitá kinetická analýza (Dual Kinetic Assay – DKA) je metoda používaná k rozlišení HPV signálu a signálu vnitřní kontroly. Interní kontrola a HPV 16 amplikon jsou detekovány sondami s rychlou kinetikou emise světla (flasher). Signál vnitřní kontroly v každé reakci je rozlišovánn od signálu HPV 16 velikostí signálu vyzařování světla. Amplikony specifické pro HPV 18 a 45 jsou detekovány pomocí sond s relativně pomalejší kinetikou emise světla (glower).
Související produkty:
Myslíme na naše životní prostředí