GUTTA » Panther systém

Panther systém

Kategorie: ,

Popis

Panther systém

 

Úvod

Systém PANTHER je integrovaný systém pro testování nukleových kyselin, který plně automatizuje všechny kroky potřebné k provedení analýz APTIMA, od zpracování vzorku, přes amplifikaci, detekci a redukci dat.

 

Přehled přístroje

Systém PANTHER se skládá ze zařízení a počítače, které tvoří jednu jednotku. Přístroj se obsluhuje pomocí monitoru s dotykovým displejem, který je součástí systému. Komunikaci s přístrojem řídí několik elektronických desek, které se nazývají komunikační a organizační procesor (COP). COP se používá k řízení provozu subsystémů během provádění kroků analýz a také umožňuje propojení s LIS a přístup vzdáleného uživatele.

 

Přehled technologie

Analýzy APTIMA jsou amplifikační testy nukleové kyseliny, které detekují DNA a RNA z různých schválených typů pacientských vzorků a odběrových prostředků, v souladu s příbalovou informací příslušného testu.

 

Všechny analýzy APTIMA používají následující technologie chráněné autorským právem:

  • Zachycení cíle- izolace a purifikace nukleové kyseliny ze vzorku.
  • Transkripčně zprostředkovaná amplifikace (TMA)- amplifikace cílové nukleové kyseliny s cílem vytvoření více kopií RNA pro snadnější detekci.
  • Analýza s hybridizační ochranou (HPA)- detekce amplifikované nukleové kyseliny s použitím sond nukleové kyseliny emitujících světlo.
  • Dvojitá kinetická analýza (DKA)- analýza kinetiky chemiluminiscence pro rozlišení dvou signálů v jedné zkumavce.
  • Vnitřní kontroly- používají se pro kontrolu zachycení nukleové kyseliny, amplifikace, detekce a chyb operátora nebo přístroje.

 

Zachycení cíle

Proces zachycení cíle izoluje nukleovou kyselinu hledaného viru a purifikuje nukleovou kyselinu pro amplifikaci.

  1. 1.  Jednotka MTU je zvednuta ze vstupní fronty a umístěna do stanice pro pipetování vzorků.

a) Reagencie wTCR (udržovaná v suspenzi rotačním mícháním) je napipetována do zkumavek jednotky MTU. Pro pipetování reagencie wTCR do všech pěti reakčních zkumavek v MTU se používá jedna jednorázová špička.

b) Chlazený vzorek se pipetuje do každé zkumavky individuálními špičkami. Po přidání každého vzorku pipetor ověří, že reagencie wTCR i vzorek byly napipetovány přesně.
c) Distributor přesune jednotky MTU do stanice pro míchání vzorků, kde jsou kapaliny promíchány.
d) Jednotka MTU se přesune do vysokoteplotního inkubátoru za účelem zachycení cíle. V tomto kroku se záchytné oligomery hybridizují k cílové sekvenci nukleové kyseliny obsažené v pacientském vzorku. U některých analýz v tomto bodě také dochází k lýze buněk.
e) Jednotka MTU se přesune do přechodového inkubátoru, kde koncové sekvence komplexu záchytný oligomer/cílová nukleová kyselina hybridizují k magnetickým částicím.
f) Jednotka MTU je ochlazena na chladicí rampě a přesune se do parkovacího místa, kde magnety přitáhnou magnetické pelety wTCR ke stranám zkumavek MTU.

  1. 2. Jakmile jsou wTCR pelety zachyceny, jednotka MTU se přesune do modulu pro magnetické propírání (mag wash), kde je zachycený cíl separován z reziduální kapaliny. Při magnetickém propírání dochází ke vstřikování promývacího roztoku, míchání, zachycování pelet a aspiraci reziduální kapaliny, aby se odstranily zbytky vzorku a reagencie wTCR.
  2. 3. Pro aspiraci se používá podtlakový systém, což zajišťuje optimální proudění vzduchu a omezuje tvorbu aerosolu. Po závěrečné aspiraci je do jednotky MTU přidán olej, aby se omezilo vypařování během zbývající části analýzy.
  3. 4. Po dokončení magnetického propíracího cyklu je purifikovaná cílová nukleová kyselina připravena k amplifikaci pomocí transkripčně zprostředkované amplifikace.

 

Transkripčně zprostředkovaná amplifikace

Transkripčně zprostředkovaná amplifikace (TMA) používá dva enzymy (reverzní transkriptázu a RNA polymerázu) k vytvoření mnoha miliard kopií RNA amplifikované cílové sekvence z purifikované cílové nukleové kyseliny.

Proces amplifikace trvá přibližně hodinu.

  1. 1. Jednotka MTU je přenesena do zakládací stanice AMP, kde je do každé zkumavky napipetována amplifikační reagencie a poté proběhne míchání.
  1. 2. Jednotka MTU je pak přenesena zpět do vysokoteplotního inkubátoru pro nasednutí primeru, což podporuje navázání primerů k cílové nukleové kyselině.
  1. 3. Jednotka MTU se přesune do přechodového inkubátoru k ochlazení před přidáním enzymatické reagencie.
  1. 4. Jednotka MTU se přesune do zakládací stanice AMP. Pipetor přidá enzymatickou reagencii. Jednotka MTU je zamíchána a přenesena do inkubátoru AMP/RT pro amplifikaci při 42,7 °C.
    a) Reverzní transkriptáza používá primery k vytvoření DNA kopie cílové rRNA. Pokud je cílem DNA, proces přeskočí ke kroku d.
    b) Aktivity ribonukleázy H reverzní transkriptázy narušují původní cílovou RNA.
    c) Druhý primer se váže na novou kopii DNA a reverzní transkriptáza vytvoří dvojřetězcový duplex DNA.
    d) RNA polymeráza procesem transkripce vytváří další RNA kopie DNA templátu.
    e) Proces se opakuje až do vyčerpání reagencie.
  1. 5. Amplifikovaná RNA neboli amplikon je připravena k hybridizaci s označenou sondou kyseliny nukleové v analýze s hybridizační ochranou.

 

Analýza s hybridizační ochranou (Hybridization ProtectionAssay – HPA)

Analýza s hybridizační ochranou (Hybridization Protection Assay – HPA) váže amplikon na jednořetězcové sondy nukleové kyseliny, které jsou označené molekulou acridinium esteru (AE) a poté provádí selekci a detekci takto hybridizovaných sond.

  1. 1. Systém přesune jednotku MTU do zakládací stanice HPA. Pipetor napipetuje reagencii sondy do zkumavek a stanice obsah zkumavek promíchá. Reagencie sondy obsahuje oligonukleotidy označené AE. Sekvence sond je specificky komplementární k cílovému amplikonu. Pokud je amplikon přítomen, naváže se (hybridizuje) na sondy.
  1. 2. Jednotka MTU se přesune do vysokoteplotního inkubátoru za účelem hybridizace.
  2. 3. Po hybridizaci se jednotka MTU přesune do zakládací stanice HPA, kde je přidána selekční reagencie a provedeno míchání.
  1. 4. Jednotka MTU se přesune zpět do vysokoteplotního inkubátoru za účelem selekce. Ve fázi selekce jsou hybridizované a nehybridizované sondy rozlišeny prostřednictvím deaktivace AE označení na nehybridizovaných sondách. Během detekce je luminometrem měřen chemiluminiscenční signál vydávaný hybridizovanou sondou a hodnota je hlášena v relativních jednotkách světla (relative light units – RLU). Neaktivní AE v průběhu detekce světlo nevydává.
  1. 5. Systém napipetuje reagencie Auto Detect 1 a 2 do jednotek MTU. Reagencie Auto Detect 1 a 2 reagují s molekulami AE, což vede k emisi fotonů (světelného signálu).
  1. 6. Luminometr zaznamená přítomný světelný signál.
  1. 7. Jakmile luminometr změří signál molekuly AE, jednotka MTU se přesune do výstupní fronty. Systém vstříkne do MTU roztok NaOCl a deaktivační pufr pro likvidaci jakéhokoliv přítomného amplikonu. Jednotka MTU setrvá ve frontě po dobu 15 minut, kdy dochází k dekontaminaci. Systém pak aspiruje kapaliny do nádoby na kapalný odpad a uloží jednotky MTU, pipetovací špičky a mikrošpičky do nádoby na tuhý odpad.

 

Dual Kinetic Assay (dvojitá kinetická analýza) (DKA)

Testy APTIMA mohou také používat technologii dvojité kinetické analýzy (Dual Kinetic Assay – DKA) k vícenásobné detekci z jediného vzorku. Při DKA dovolují rozdíly mezi kinetickými profily značených sond diferenciaci signálu. Kinetické profily jsou odvozeny z měření výstupu fotonů při načítání detekce. Když chemiluminiscenční detekční reakce pro signál má velmi rychlou kinetiku, nazývá se kinetický typ “flasher”. Když chemiluminiscenční detekční reakce pro signál má relativně pomalejší kinetiku, nazývá se kinetický typ “glower”.

 

Vnitřní kontrola

Analýzy APTIMA mohou používat pro kontrolu zachycení nukleové kyseliny, amplifikace, detekce a chyb operátora nebo přístroje vnitřní kontrolu. Vnitřní kontrola se přidává ke každé reakci prostřednictvím pracovní reagencie pro zachycení cíle. Signál vnitřní kontroly je při každé reakci odlišen od cílového signálu podle odlišné kinetiky světla emitovaného ze sond s různým označením. Amplikon specifický pro vnitřní kontrolu je detekován sondou s rychlou emisí světla (flasher). Amplikon specifický pro cíl je detekován pomocí sond s relativně pomalejší kinetikou emise světla (glower).

 

Související produkty:

DTS systém

Tomcat instrument

Související produkty