Aptima HIV-1 Quant Dx assay

Popis

Aptima HIV-1 Quant Dx assay

Použitie

Test APTIMA HIV-1 Quant Dx je amplifikačný test nukleovej kyseliny pre in vitro detekciu a kvantifikáciu RNA vírusu ľudskej imunodeficiencie typu 1 (HIV-1) v plne automatizovanom systéme Panther. Je určený na použitie ako pomoc pri diagnostike infekcie HIV-1, ako potvrdenie infekcie HIV-1, a ako pomoc pri klinickej liečbe pacientov infikovaných vírusom HIV-1.

Test APTIMA HIV-1 Quant Dx môže byť použitý (slúži) ako pomoc pri diagnóze infekcie HIV-1, vrátene akútnej alebo primárnej infekcie. Prítomnosť RNA HIV-1 v plazme alebo sére pacientov bez protilátok proti HIV-1 svedčí o akútnej alebo primárnej HIV-1 infekcii. Test APTIMA HIV-1 Quant Dx môže byť použitý ako doplnkový test pre vzorky, ktoré majú opakované reaktívne výsledky s preukázanými HIV imunologickými testami. V prípade, že je vzorka reaktívna v teste APTIMA HIV-1 Quant Dx, tak je infekcia HIV-1 potvrdená.

Test APTIMA HIV-1 Quant Dx možno tiež použiť v spojení s klinickými prejavmi a ďalšími laboratórnymi markermi pre určenie prognózy ochorenia u HIV-1 infikovaných osôb. Test APTIMA HIV-1 Quant Dx môže byť použitý ako pomoc pri sledovaní účinku antiretrovírusovej liečby meraním zmeny v koncentrácii RNA HIV-1 v plazme.

Ak sa používa test APTIMA HIV-1 Quant Dx ako pomoc pri diagnóze infekcie HIV-1, výkonnosť pre kvalitatívne výsledky sa stanoví z oboch, ako zo vzoriek plazmy, tak aj zo vzoriek séra. Pokiaľ sa používa ako pomoc pri sledovaní účinku antiretrovírusovej terapie, výkonnosť pre kvantitatívne výsledky sa stanoví iba zo vzorky plazmy. Vzorky séra nemôžu byť použité pre stanovenie kvantitatívnych výsledkov.

Tento test nie je určený pre použitie pri screeningu krvi alebo plazmy darcu.

Princípy metódy

Test APTIMA HIV-1 Quant Dx zahŕňa tri hlavné kroky, ktoré sa všetky vykonávajú v jednej skúmavke na systéme Panther: zachytenie cieľa, cieľová amplifikácia pomocou transkripčne sprostredkovanej amplifikácie (Transcription – Mediated Amplification – TMA), a detekcia produktov amplifikácie (amplikonov) pomocou fluorescenčnej značenej sondy.

V priebehu zachytenia cieľa sa zo vzoriek izoluje vírusová RNA. Pre rozpustenie vírusového obalu, denaturácii proteínov a uvoľneniu vírusovej genómovej RNA sa nechá vzorka reagovať s detergentom. Záchytné oligonukleotidy hybridizujú k vysoko zachovaným oblastiam RNA HIV-1, pokiaľ sú prítomné v testovanej vzorke. Hybridizovaný cieľ je následne zachytený na magnetických mikročasticiach, ktoré sú oddelené zo vzorky v magnetickom poli. Umývacie kroky odstránia nadbytočné zložky z reakčnej skúmavky.

Cieľová amplifikácia sa vykonáva pomocou TMA, čo je metóda amplifikácie nukleovej kyseliny založená na transkripcii, ktorá využíva dva enzýmy, reverznú transkriptázu MMLV a polymerázu T7 RNA. Reverzná transkriptáza sa používa k vytvoreniu kópie DNA (obsahujúcej sekvenciu promótora pre polymerázu T7 RNA) cieľovej sekvencie. Polymeráza T7 RNA produkuje viac kópií RNA amplikonov z kópie DNA templátu. Test APTIMA HIV-1 Quant Dx využíva metódu TMA pre amplifikáciu dvoch oblastí RNA HIV-1 (Pol a LTR). Amplifikáciou týchto špecifických regiónov je dosiahnuté za použitia špecifických priemerov, ktoré sú navrhnuté pre amplifikáciu HIV-1 skupín M, N a O. Design priemerov a dvojitý cieľový prístup zaistí presnú detekciu a kvantifikáciu HIV-1.

Detekcia sa vykonáva pomocou jednovláknovej sondy nukleovej kyseliny s chemiluminiscenčným označením, ktoré sú prítomné v priebehu amplifikácie cieľa a ktoré hybridizujú špecificky k amplikonu v reálnom čase. Ak nie je chemiluminiscenčná značka hybridizovaná k amplikonu, hasič (quencher) je v tesnej blízkosti fluorofóru a potláča fluorescenciu. Keď sa chemiluminiscenčná značka naviaže na amplikon, hasič (quencher) je presunutý ďalej od fluorofóru a vyšle pri excitácii so zdrojom svetla signál v špecifickej vlnovej dĺžke. Čím viac sa hybridizuje chemiluminiscenčných značiek na amplikon, tým vyšší fluorescenčný signál je generovaný. Doba potrebná pre dosiahnutie špecifickej medze fluorescenčného signálu, je priamo úmerná východiskovej koncentrácii HIV-1. Každá reakcia má vnútorný kalibrátor/vnútornú kontrolu, ktorá monitoruje rozdiely pri spracovaní vzorky, amplifikácii a detekcii. Koncentrácia vzorky sa určuje podľa softvéru systému Panther s využitím signálov HIV-1 a vnútornej kontroly pre každú reakciu a porovnáva ich kalibračnými hodnotami.