Popis
Aptima HPV 16 18/45 genotype assay
Použitie
Test APTIMA HPV 16 18/45 Genotype je amplifikačný test cieľovej sondy nukleovej kyseliny pre in vitro kvalitatívnu detekciu E6/E7 vírovej messengerovej RNA (mRNA) vysoko rizikových typov 16, 18 a 45 ľudských papillomavírov (HPV) vo vzorkách žien s pozitívnymi výsledkami testov APTIMA HPV. HPV mRNA je detekovaná v cervikálnych cytologických Pap vzorkách v tekutom médiu v skúmavkách ThinPrep obsahujúcich roztok PreservCyt pred spracovaním Pap i po ňom alebo v odobraných vzorkách pomocou odberovej a transportnej súpravy APTIMA. Tento test možno použiť k testovaniu vzoriek systémom TIGRIS DTS alebo systémom PANTHER.
Princípy metódy
Test APTIMA HPV 16 18/45 Genotype zahŕňa tri hlavné kroky, ktoré sa vykonávajú v jednej skúmavke: zachytenie cieľa; cieľová amplifikácia pomocou transkripčne sprostredkovanej amplifikácie (Transcription- Mediated Amplification – TMA), a detekcie produktov amplifikácie (amplikonov) pomocou testu hybridizačnej ochrany (Hybridization Protection Assay – HPA). Test zahŕňa vnútornú kontrolu, ktorá monitoruje zachytenie nukleovej kyseliny, amplifikáciu a detekciu, a takisto chyby operátora alebo prístroja.
Vzorky sa odoberajú alebo sú prenesené do skúmavky obsahujúcej transportné médium, ktoré lýzuje bunky, uvoľňuje mRNA a chráni ich pred degradáciou v priebehu uchovávania. Keď sa vykonáva test APTIMA HPV 16 18/45 Genotype, cieľová mRNA je zo vzorky izolovaná pomocou záchytných oligomerov, ktoré sú viazané na magnetické mikročastice. Záchytné oligomery obsahujú sekvencie, ktoré sú komplementárne ku špecifickým oblastiam HPV mRNA cieľových molekúl, rovnako ako reťazec deoxyadenosinových zbytkov. Počas hybridizačného kroku sa sekvenčne špecifické oblasti záchytných oligomerov vážia na špecifické oblasti cieľovej molekuly HPV mRNA. Komplex záchytného oligomera a cieľa je potom vychytávaný z roztoku znížením teploty reakcie na pokojovou teplotu.
Toto zníženie teploty umožňuje hybridizáciu medzi deoxyadenosinovú oblasť na záchytnom oligomery a polydeoxythimidinovými molekulami, ktoré sú kovalentne naviazané k magnetickým časticiam. Mikročastice, vrátane zachytených cieľových molekúl HPV mRNA, ktoré sú na ne naviazané, sú zaťažené ku strane reakčnej skúmavky pomocou magnetov a supernatant sa odsaje. Častice sa premyjú, aby sa odstránila reziduálna matrica vzoriek, ktorá môže obsahovať inhibítory amplifikácie.
Po dokončení zachytenia cieľa je HPV mRNA amplifikovaná pomocou TMA, čo je metóda amplifikácie nukleovej kyseliny založená na transkripcii, ktorá využíva dva enzýmy, reverznú transkriptázu MMLV a polymerázu T7 RNA. Reverzná transkriptáza sa používa k vytvoreniu kópie DNA sekvencie cieľovej mRNA obsahujúcej sekvenciu promotéra pre polymerázu T7 RNA. Polymeráza T7 RNA produkuje viac kópií RNA amplikonu z kópie DNA templátu.
Detekcia amplikonu je dosiahnutá metódou HPA využívajúcou jednoreťazcové sondy nukleovej kyseliny s chemiluminiscenčnými značkami, ktoré sú komplementárne k amplikonu. Značené sondy nukleovej kyseliny hybridizujú špecificky s amplikonom. Selekčná reagencia rozlišuje hybridizovanú od nehybridizovanej sondy deaktiváciou značenia nehybridizovanej sondy. Počas detekčného kroku je svetlo vyžarované z označených hybridov RNA:DNA merané ako fotónové signály v luminometry a intenzita je hlásená ako relatívne svetelné jednotky (RLU). Konečné výsledky testu sú interpretované na základe pomerov signálov analytov k hodnote cut-off (S/CO).
Vnútorná kontrola sa pridáva do každej reakcie prostredníctvom činidla zachytenia cieľa (TCR – Target Capture Reagent). Vnútorná kontrola monitoruje zachytenie cieľa, amplifikáciu a detekčné kroky testov. Dvojitá kinetická analýza (Dual Kinetic Assay – DKA) je metóda používaná k rozlíšeniu HPV signálu a signálu vnútornej kontroly. Interná kontrola a HPV 16 amplikon sú detekované sondami s rýchlou kinetikou emisie svetla (flasher). Signál vnútornej kontroly v každej reakcii je rozlišovaný od signálu HPV 16 veľkosťou signálu vyžarovania svetla. Amplikony špecifické pre HPV 18 a 45 sú detekované pomocou sond s relatívne pomalšou kinetikou emisie svetla (glower).
Súvisiace produkty:
Myslíme na naše životné prostredie