Panther systém

Popis

Panther systém

 

Úvod

Systém PANTHER je integrovaný systém pre testovanie nukleových kyselín, ktorý plne automatizuje všetky kroky potrebné k prevedeniu analýz APTIMA, od spracovania vzoriek, cez amplifikáciu, detekciu a redukciu dát.

 

Prehľad prístroja

Systém PANTHER sa skladá zo zariadenia a počítača, ktoré tvoria jednu jednotku. Prístroj sa obsluhuje pomocou monitora s dotykovým displejom, ktorý je súčasťou systému. Komunikáciu s prístrojom riadi niekoľko elektronických dosiek, ktoré sa nazývajú komunikačný a organizačný procesor (COP). COP sa používa k riadeniu prevádzky subsystému počas vykonávania krokov analýz a tiež umožňuje prepojenie s LIS a prístup vzdialeného užívateľa.

 

Prehľad technológie

Analýzy APTIMA sú amplifikačné testy nukleovej kyseliny, ktoré detekujú DNA a RNA z rôznych schválených typov pacientskych vzoriek a odberových prostriedkov, v súlade s príbalovou informáciou príslušného testu.

 

Všetky analýzy APTIMA používajú nasledujúcu technológiu chránenú autorským právom:

• Zachytenie cieľa – izolácia a purifikácia nukleovej kyseliny zo vzorky.
• Transkripčne sprostredkovaná amplifikácia (TMA)- amplifikácia cieľovej nukleovej kyseliny s cieľom vytvorenia viacerých kópií RNA pre ľahšiu detekciu.
• Analýza s hybridizačnou ochranou (HPA)- detekcia amplifikovanej nukleovej kyseliny s použitím sond nukleovej kyseliny emitujúcich svetlo.
• Dvojitá kinetická analýza (DKA)- analýza kinetiky chemiluminiscencie pre rozlíšenie dvoch signálov v jednej skúmavke.
• Vnútorné kontroly- používajú sa na kontrolu zachytenia nukleovej kyseliny, amplifikácie, detekcie a chýb operátora alebo prístroja.

 

Zachytenie cieľa

Proces zachytenia cieľa izoluje nukleovú kyselinu hľadaného víru a purifikuje nukleovú kyselinu pre amplifikáciu.

1.  Jednotka MTU je zdvihnutá zo vstupnej fronty a umiestnená do stanice pre pipetovanie vzoriek.
   a) Reagencie wTCR (udržovaná v suspenzii rotačným miešaním) je napipetovaná do skúmaviek jednotky MTU. Pre pipetovanie reagencie wTCR do všetkých piatich reakčných skúmaviek v MTU sa používa jedna jednorazová špička.
   b) Chladenie vzoriek sa pipetuje do každej skúmavky individuálnymi špičkami. Po pridaní každej vzorky pipetor overí, že reagencia wTCR a vzoriek boli napipetované presne.
   c) Distribútor presunie jednotky MTU do stanice pre miešanie vzoriek, kde sú kvapaliny premiešané.
   d) Jednotka MTU sa presunie do vysokoteplotného inkubátora za účelom zachytenia cieľa. V tomto kroku sa záchytné oligomery hybridizujú k cieľovej sekvencii nukleovej kyseliny obsiahnuté vo vzorke pacienta. U niektorých analýz v tomto bode tiež dochádza k lýze buniek.
   e) Jednotka MTU sa presunie do prechodového inkubátora, kde koncové sekvencie komplexu záchytný oligomer/cieľová nukleová kyselina hybridizujú k magnetickým časticiam.
   f) Jednotka MTU je ochladená na chladiacej rampe a presunie sa do parkovacieho miesta, kde magnety pritiahnu magnetické pelety wTCR ku stranám skúmaviek MTU.
2. Akonáhle sú wTCR pelety zachytené, jednotka MTU sa presunie do modulu pre magnetické prepieranie (mag wash), kde je zachytený cieľ separovaný z reziduálnej kvapaliny. Pri magnetickom prepieraní dochádza ku vstrekovaniu premývacieho roztoku, miešanie, zachytávanie peliet a aspiráciu reziduálnej kvapaliny, aby sa odstránili zbytky vzoriek a reagencie wTCR.
3. Na aspiráciu sa používa podtlakový systém, čo zaisťuje optimálne prúdenie vzduchu a obmedzuje tvorbu aerosolov. Po záverečnej aspirácii je do jednotky MTU pridaný olej, aby sa obmedzilo vyparovanie počas zostávajúcej časti analýzy.
4. Po dokončení magnetického prepieracieho cyklu je purifikovaná cieľová nukleová kyselina pripravená k amplifikácii pomocou transkripčne sprostredkovanej amplifikácie.

 

Transkripčne sprostredkovaná amplifikácia

Transkripčne sprostredkovaná amplifikácia (TMA) používa dva enzýmy (reverznú transkriptázu a RNA polymerázu) k vytvoreniu mnohých miliárd kópií RNA amplifikovanej cieľovej sekvencie z purifikovanej cieľovej nukleovej kyseliny.

Proces amplifikácie trvá približne hodinu.

1. Jednotka MTU je prenesená do zakladacej stanice AMP, kde je do každej skúmavky napipetovaná amplifikačná reagencia a potom prebehne miešanie.

2. Jednotka MTU je potom prenesená späť do vysokoteplotného inkubátora pre nasadnutie priemeru, čo podporuje naviazanie priemerov k cieľovej nukleovej kyseline.

3. Jednotka MTU sa presunie do prechodového inkubátora k ochladeniu pred pridaním enzymatickej reagencie.

4. Jednotka MTU sa presunie do zakladacej stanice AMP. Pipetor pridá enzymatickú reagenciu. Jednotka MTU je zamiešaná a prenesená do inkubátora AMP/RT pre amplifikáciu pri 42,7 °C.
   a) Reverzná transkriptáza používa priemery k vytvoreniu DNA kópie cieľovej rRNA. Pokiaľ je cieľom DNA, proces preskočí ku kroku d.
   b) Aktivity ribonukleázy H reverznej transkriptázy narušujú pôvodnú cieľovú RNA.
   c) Druhý priemer sa viaže na novú kópiu DNA a reverzná transkriptáza vytvorí dvojreťazcový duplex DNA.
   d) RNA polymeráza procesom transkripcie vytvára ďalšie RNA kópie DNA templátov.
   e) Proces sa opakuje až do vyčerpania reagencie.

5. Amplifikovaná RNA čiže amplikon je pripravený k hybridizácii s označenou sondou kyseliny nukleovej v analýze s hybridizačnou ochranou.

 

Analýza s hybridizačnou ochranou (Hybridization ProtectionAssay – HPA)

Analýza s hybridizačnou ochranou (Hybridization Protection Assay – HPA) viaže amplikon na jednoreťazcové sondy nukleovej kyseliny, ktoré sú označené molekulou acridinium esteru (AE) a potom vykonáva selekciu a detekciu takto hybridizovaných sond.

1. Systém presunie jednotku MTU do zakladacej stanice HPA. Pipetor napipetuje reagenciu sondy do skúmaviek a stanica obsah skúmaviek premieša.
   Reagencia sondy obsahuje oligonukleotidy označené AE. Sekvencia sond je špecificky komplementárna k cieľovému amplikonu.
   Pokiaľ je amplikon prítomný, naviaže sa (hybridizuje) na sondy.

2. Jednotka MTU sa presunie do vysokoteplotného inkubátora za účelom hybridizácie.
3. Po hybridizácii sa jednotka MTU presunie do zakladacej stanice HPA, kde je pridaná selekčná reagencia a vykoná sa miešanie.

4. Jednotka MTU sa presunie späť do vysokoteplotného inkubátora za účelom selekcie.
   Vo fáze selekcie sú hybridizované a nehybridizované sondy rozlíšené prostredníctvom deaktivácie AE označenia na nehybridizovaných sondách. Počas detekcie je luminometrom meraný chemiluminiscenčný signál vydávaný hybridizovanou sondou a hodnota je hlásená v relatívnych jednotkách svetla (relative light units – RLU). Neaktívny AE v priebehu detekcie svetlo nevydáva.

5. Systém napipetuje reagencie Auto Detect 1 a 2 do jednotiek MTU. Reagencie Auto Detect 1 a 2 reagujú s molekulami AE, čo vedie k emisii fotónov (svetelného signálu).

6. Luminometer zaznamená prítomný svetelný signál.

7. Akonáhle luminometer zmeria signál molekuly AE, jednotka MTU sa presunie do výstupnej fronty. Systém vstrekne do MTU roztok NaOCl a deaktivačný pufr pre likvidáciu akéhokoľvek prítomného amplikonu. Jednotka MTU zotrvá vo fronte po dobu 15 minút, kedy dochádza k dekontaminácii. Systém následne aspiruje kvapaliny do nádoby na kvapalný odpad a uloží jednotky MTU, pipetovacej špičky a mikrošpičky do nádoby na tuhý odpad.

 

Dual Kinetic Assay (dvojitá kinetická analýza) (DKA)

Testy APTIMA môžu tiež používať technológiu dvojitej kinetickej analýzy (Dual Kinetic Assay – DKA) k viacnásobnej detekcii z jedinej vzorky. Pri DKA dovoľujú rozdiely medzi kinetickými profilmi značených sond diferenciáciu signálu. Kinetické profily sú odvodené z meraní výstupu fotónov pri načítaní detekcie. Keď chemiluminiscenčné detekčné reakcie pre signál majú veľmi rýchlu kinetiku, nazýva sa kinetický typ “flasher”. Keď chemiluminiscenčná detekčná reakcia pre signál má relatívne pomalšiu kinetiku, nazýva sa kinetický typ “glower”.

 

Vnútorná kontrola

Analýzy APTIMA môžu používať pre kontrolu zachytenia nukleovej kyseliny, amplifikácie, detekcie a chýb operátora alebo prístroja vnútornú kontrolu. Vnútorná kontrola sa pridáva ku každej reakcii prostredníctvom pracovnej reagencie pre zachytenie cieľa. Signál vnútornej kontroly je pri každej reakcii odlíšený od cieľového signálu podľa odlišnej kinetiky svetla emitovaného zo sond s rôznym označením. Amplikon špecifický pre vnútornú kontrolu je detekovaný sondou s rýchlou emisiou svetla (flasher). Amplikon špecifický pre cieľ je detekovaný pomocou sond s relatívne pomalšou kinetikou emisie svetla (glower).

 

Súvisiace produkty:

DTS systém

Tomcat instrument